tRNA-sgRNA/Cas9系统介导多年生黑麦草原生质体的基因编辑

doi:10.11686/cyxb2022180

摘要/Abstract

摘要：

tRNA可以将多个sgRNAs连接起来合并成一个多顺反子基因，再与CRISPR/Cas9表达载体结合形成多顺反子tRNA-sgRNA/Cas9（PTG/Cas9）系统来对多靶点进行基因编辑。该系统已经在水稻中验证其可促进sgRNAs的转录和提高多靶点的编辑效率。因此，为了在多年生黑麦草中实现高效的基因编辑，本研究中，构建了2个带有tRNA的CRISPR中间载体，并提供了一种快速、灵活的PTG/Cas9载体构建方法。为了快速验证PTG/Cas9系统是否可以在多年生黑麦草基因组中发挥功能，用聚乙二醇4000（PEG 4000）介导PTG/Cas9质粒转化多年生黑麦草原生质体，后提取原生质体DNA扩增目的序列检测是否有目标基因被编辑的细胞。试验结果显示，PTG/Cas9系统可用于多年生黑麦草基因编辑，且基因编辑效率约为6.7%。试验结果为多年生黑麦草遗传研究和育种提供了重要的基础。

关键词: CRISPR/Cas9, tRNA, 多基因编辑, 载体, 质粒, 原生质体, 多年生黑麦草

Abstract:

Transfer RNA （tRNA） can link multiple sgRNAs （single-guide RNAs） to form a polycistronic gene， which then combines with a CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated gene 9） expression vector to form a polycistronic tRNA-sgRNA/Cas9 （PTG/Cas9） system for multiple gene editing. The PTG/Cas9 system has been used to alter sgRNAs transcript levels and improve multi-target editing efficiency in rice （Oryza sativa）. To efficiently edit target genes in perennial ryegrass （Lolium perenne）， we generated two CRISPR intermediate vectors with tRNAs to provide a fast and flexible PTG/Cas9 vector construction method. To verify whether the PTG/Cas9 system effectively edits genes in the perennial ryegrass genome， we introduced the PTG/Cas9 plasmid into perennial ryegrass protoplasts by PEG 4000-mediated transformation. Then， we extracted DNA from protoplasts and amplified the target sequences to determine whether they had been edited successfully. The gene editing efficiency was about 6.7%. These results show that the PTG/Cas9 system can be used for gene editing in the ryegrass genome， and provide the basis for further genetic research on， and breeding of perennial ryegrass.

Key words: CRISPR/Cas9, tRNA, multiple gene editing, vector, plasmid, protoplasts, perennial ryegrass

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图/表 10

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引物Primer	引物序列Primer sequence （5′-3′）
S1F	TTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCT
S1R	ACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAGTATGTTATCTTCAGAGGTCTCTTGCACCAGCCGGGAATCGAACC
S2F	CCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCAGCGTGGGTCTCGGTTTTAGAG
S2R	CTGCACATCTGATTCCTCCAAGATCCATGCATGCCTGATAACTTTAAGTTGCTTCAGAAGA
F1	CTCCGTTTTACCTGTGGAATC
R1	TCAACAATATCGTATCAATTTGCACCAGCCGG
F2	AATTGATACGATATTGTTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
R2	CGGAGGAAAATTCCATCCAC
F3	GGCTCGTATGTTGTGTGG
R3	CGTGTCGGTGTCAGCAAATATGCACCAGCCGG
F4	TATTTGCTGACACCGACACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
F5	TTCAGAGGTCTCTACCGTGGAATCGGCAGCAAA
R5	TTCAGAGGTCTCACGAATTCTCAGGTGCACCAGCCGG
F6	GAGGTCTCGTTCGTATACGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
R6	AGCGTGGGTCTCGCTCGTCCATCCACTCCAAGC
F7	GCGAGCCTTATAAGCAG
R7	GCTGAGATAACGAGCCAA

引物Primer	引物序列Primer sequence （5′-3′）
S1F	TTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCT
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S2F	CCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCAGCGTGGGTCTCGGTTTTAGAG
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F1	CTCCGTTTTACCTGTGGAATC
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R2	CGGAGGAAAATTCCATCCAC
F3	GGCTCGTATGTTGTGTGG
R3	CGTGTCGGTGTCAGCAAATATGCACCAGCCGG
F4	TATTTGCTGACACCGACACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
F5	TTCAGAGGTCTCTACCGTGGAATCGGCAGCAAA
R5	TTCAGAGGTCTCACGAATTCTCAGGTGCACCAGCCGG
F6	GAGGTCTCGTTCGTATACGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
R6	AGCGTGGGTCTCGCTCGTCCATCCACTCCAAGC
F7	GCGAGCCTTATAAGCAG
R7	GCTGAGATAACGAGCCAA

步骤Steps	反应组分Reaction components	组分名称Component name	体积Volume （μL）
PCR组分 Components of the PCR	PCR缓冲液PCR buffer	2×Phanta Max buffer	15.0
	DRT	dNTP Mix （10 mmol·L^-1）	0.6
	模板Template	POT/PT （100 ng·L^-1）	1.0
	上游引物Forward primer	F1/F2/F3/F4 （10 μmol·L^-1）	1.2
	下游引物Reverse primer	R1/R2/R3/R2 （10 μmol·L^-1）	1.2
	DNA聚合酶DNA polymerase	Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase	0.6
	双蒸水Double distilled water	ddH₂O	10.4
	共计Total		30.0
重叠式PCR Overlapping PCR	PCR缓冲液PCR buffer	2×Phanta Max buffer	15.0
	DRT	dNTP Mix （10 mmol·L^-1）	0.6
	模板Template	产物1、产物2/产物3、产物4 Product 1， product 2/product 3， product 4	1.0+1.0
	上游引物Forward primer	F5/F6 （10 μmol·L^-1）	1.2
	下游引物Reverse primer	R5/R6 （10 μmol·L^-1）	1.2
	DNA聚合酶DNA polymerase	Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase	0.6
	双蒸水Double distilled water	ddH₂O	9.4
	共计Total		30.0
金门组装反应 Golden gate assembly	缓冲液Buffer	10×CutSmart	1.0
	缓冲液Buffer	10×T4 DNA ligase buffer	1.0
	连接产物Products for connection	产物5 Product 5	2.5
	连接产物Products for connection	产物6 Product 6	2.5
	表达载体Expression vector	pYLCRISPR Cas9Pubi-H	2.0
	限制性内切酶Restriction enzyme	Bsa I	0.5
	连接酶Ligase	T4 DNA ligase	0.5
	共计Total		10.0

步骤Steps	反应组分Reaction components	组分名称Component name	体积Volume （μL）
PCR组分 Components of the PCR	PCR缓冲液PCR buffer	2×Phanta Max buffer	15.0
	DRT	dNTP Mix （10 mmol·L^-1）	0.6
	模板Template	POT/PT （100 ng·L^-1）	1.0
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	DNA聚合酶DNA polymerase	Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase	0.6
	双蒸水Double distilled water	ddH₂O	10.4
	共计Total		30.0
重叠式PCR Overlapping PCR	PCR缓冲液PCR buffer	2×Phanta Max buffer	15.0
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	DNA聚合酶DNA polymerase	Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase	0.6
	双蒸水Double distilled water	ddH₂O	9.4
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金门组装反应 Golden gate assembly	缓冲液Buffer	10×CutSmart	1.0
	缓冲液Buffer	10×T4 DNA ligase buffer	1.0
	连接产物Products for connection	产物5 Product 5	2.5
	连接产物Products for connection	产物6 Product 6	2.5
	表达载体Expression vector	pYLCRISPR Cas9Pubi-H	2.0
	限制性内切酶Restriction enzyme	Bsa I	0.5
	连接酶Ligase	T4 DNA ligase	0.5
	共计Total		10.0

常规PCR Regular PCR			重叠式PCR Overlapping PCR			金门组装Golden gate assembly
步骤Step	温度Temperature （℃）	时间Time （s）	步骤Step	温度Temperature （℃）	时间Time （s）	步骤Step	温度Temperature （℃）	时间Time （s）
1	95	180	1	95	180	1	37	300
2	95	15	2	95	15	2	16	600
3	60	15	3	60	15	3	-	7200
4	72	30	4	72	30
5	-	2100	5	-	2100
6	72	300	6	72	3000