多年生黑麦草细胞分裂素信号通路B类ARR转录因子LpARR10的耐镉功能分析

doi:10.11686/cyxb2021097

摘要/Abstract

摘要：

镉（Cd）是矿区重金属污染的主要元素之一，严重限制了植物的生长、发育。细胞分裂素（CTK）能够缓解镉对植物的毒害，但具体机制尚不清楚。本研究克隆了多年生黑麦草CTK信号通路基因LpARR10，该基因具有6个外显子，编码598个氨基酸。进化分析表明，LpARR10与拟南芥B类ARR转录因子（B-ARRs）聚为一组，其中与AtARR10和AtARR12的亲缘关系较近。氨基酸序列分析结果显示，LpARR10具有B-ARRs典型的磷酸受体结构域、磷酸化和金属离子结合位点。表达模式分析表明，CTK（25 μmol·L^-1 6-BA）和Cd（200 μmol·L^-1 CdCl₂）处理0.5、2、6、12、24和48 h均显著提高了黑麦草根部LpARR10的表达；而在叶片中，LpARR10的表达仅在CTK和Cd处理2和6 h后显著升高。过量表达LpARR10转基因和野生型拟南芥在无Cd的MS培养基上生长10 d后，根长和鲜重没有显著差异；而在含有Cd（180 μmol·L^-1 CdCl₂）的MS培养基中，过量表达转基因株系的根长和鲜重显著高于野生型对照。综上，LpARR10在细胞分裂素调控的植物耐镉机理中发挥重要作用。

关键词: 多年生黑麦草, 细胞分裂素, LpARR10基因, 镉胁迫, 转基因拟南芥

Abstract:

Cadmium （Cd） is one of the major elements causing heavy metal pollution in mining areas that can severely inhibit plant growth and development. It is known that cytokinin （CTK） can enhance plant Cd tolerance， but its underlying mechanism is still unclear. In this study， a CTK signal pathway gene， LpARR10， was cloned in perennial ryegrass that has six exons and encodes 598 amino acids. Evolutionary analysis indicated that LpARR10was clustered together with the Arabidopsis B-type ARR transcription factors （B-ARRs） and closely related to AtARR10 and AtARR12. Protein sequence analysis demonstrated that LpARR10 has typical functional domains of B-ARRs featured with a phosphate receptor domain， phosphorylation sites， and metal ion binding sites. Expression analysis showed that both CTK （25 μmol·L^-1 6-BA） and Cd （200 μmol·L^-1 CdCl₂） significantly promoted the transcription of LpARR10 in roots of perennial ryegrass after 0.5， 2， 6， 12， 24 and 48 h of treatment and in leaves after 2 and 6 h. When grown in MS medium， there was no significant difference in root length and fresh weight between transgenic lines and wild type plants. However， the root length and fresh weight of the transgenic lines were significantly higher than those of the wild type plants when grown in MS medium with Cd （180 μmol·L^-1 CdCl₂）. In conclusion， LpARR10 plays an important role in cytokinin-regulated plant Cd tolerance.

Key words: perennial ryegrass, cytokinin, LpARR10 gene, cadmium stress, transgenic Arabidopsis

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图/表 7

表1 试验所用引物

Table 1 Primers used in the study

引物名称Primer	上游引物序列Forward primer sequence （5′-3′）	下游引物序列Reverse primer sequence （5′-3′）
LpARR10-CDS	ATTTggatccATGCGCGTGCTCGCCGTC	ATTTactagtGACCAGCTGCCAGTCCCCAT
LpARR10-qRT	GATGTCGGGAATACGGGCGG	GAGCCCCCTTTGCAGCCTAC
AtTUBULIN4-qRT	CTGTTTCCGTACCCTCAAGC	AGGGAAACGAAGACAGCAAG
Bar gene	TCAAATCTCGGTGACGGGCAGGAC	AACCGCAGGAGTGGACGGACGA

图1 LpARR10与拟南芥ARR转录因子的系统进化树

Fig.1 Phylogenetic tree of LpARR10and Arabidopsis ARRtranscription factors

图2 LpARR10的基因组结构及其同源基因的氨基酸序列和功能域分析a：多年生黑麦草LpARR10的基因组结构。黑色框代表外显子，灰色框代表内含子，黑色框里数字代表外显子碱基数；b： LpARR10与其同源基因氨基酸序列和功能域分析。红线标注区域为B类ARR转录因子典型的phosphoaccepter receiver domain（REC）功能域，红色三角形标注氨基酸D为金属结合位点，紫色箭头标注氨基酸S为磷酸化结合位点，YXXK是B-ARRs功能域（active site，红色三角形标注）。图中ARRs基因的NCBI登录号分别为：多年生黑麦草LpARR10 （ALT32069.1， L. perenne）；大麦HvARR12 （KAE8766928.1， H. vulgare）；水稻OsORR24 （XP_015626716.1， O. sativa）；高粱SbARR12 （XP_002453411.1， S. bicolor）；拟南芥AtARR12 （AT2G25180， A. thaliana）和AtARR10 （AT4G31920， A. thaliana）。 a： Genome structure of perennial ryegrass LpARR10. The black box represents exons， the gray box represents introns， and the number in the black box represents the base number in each exon. b： Amino acid sequence and functional domain analysis of LpARR10 and its homologous genes. The red line represents the REC functional domain of type-B ARR transcription factors. The red triangle represents the metal binding site of amino acid D， and the purple arrow represents the phosphorylated binding site of amino acid S. YXXK is the B-ARRS functional domain （active site， highlighted in red triangle）. NCBI registration numbers of ARRs genes in the figure are as follows： LpARR10 （ALT32069.1， L. perenne）； HvARR12 （KAE8766928.1， H. vulgare）； OsORR24 （XP_015626716.1， O. sativa）； SbARR12 （XP_002453411.1， S. bicolor）； AtARR12 （AT2G25180， A. thaliana） and AtARR10 （AT4G31920， A. thaliana）.

Fig.2 Genetic structure， amino acid sequence and function domain analysis of LpARR10 and its homologus genes

图3 外源细胞分裂素处理下多年生黑麦草叶片和根中LpARR10基因表达分析*： P<0.05， **： P<0.01， ***： P<0.001. 下同The same below.

Fig.3 Expression analysis of LpARR10 gene in perennial ryegrass leaves and roots treated with cytokinin

图4 镉处理下多年生黑麦草叶片和根中LpARR10基因表达

Fig.4 LpARR10 gene expression in leaves and roots of perennial ryegrass under cadmium treatment

图5 LpARR10转基因阳性株系的鉴定M代表DNA指示带，ND代表未检测出数据，不同字母表示差异显著（P<0.05）。下同。M represents DNA indicator band， ND represents no data detected， and different letter represents significant difference （P<0.05）. The same below.

Fig.5 Identification of LpARR10 overexpression transgenic lines

图6 镉处理条件下转基因株系和野生型拟南芥鲜重和根长

Fig.6 Fresh weight and root length in transgenic lines and wild type Arabidopsis when treated with Cd

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