细叶百合LpDREB9基因克隆及耐旱性分析

doi:10.11686/cyxb2024099

摘要/Abstract

摘要：

AP2/ERF转录因子是植物特有的一类转录因子，其中DREB亚家族蛋白被广泛报道可以提高植物对非生物胁迫的抵抗能力。为了开发细叶百合DREB家族的功能基因资源，验证DREB转录因子与耐旱调控相关性，本研究以细叶百合根部cDNA为模板，克隆得到LpDREB9基因，对其进行生物信息学分析、亚细胞定位，并通过该基因转化模式植物烟草，开展LpDREB9转录因子耐旱机制方面的研究。结果表明：LpDREB9基因的开放阅读框（ORF）为462 bp，编码153个氨基酸，蛋白的相对分子量为17.054 kDa，脂肪系数为73.46，pI值为4.89，为不稳定且具亲水性的蛋白。亚细胞定位结果表明LpDREB9蛋白定位于细胞核，同源比对结果表明LpDREB9蛋白与岷江百合的同源基因进化关系最为密切。另外通过对野生烟草种子（WT）和转基因LpDREB9烟草种子、幼苗进行脱落酸（abscisic acid，ABA）和干旱胁迫以及对成苗进行自然干旱胁迫及复水后的表型和生理指标的测定，发现LpDREB9基因增强了转基因烟草的耐旱性，并且随着干旱胁迫时间的增加，LpDREB9转基因烟草中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性、叶绿素以及脯氨酸（proline，Pro）含量明显高于WT（P<0.05），而丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量则显著低于WT（P<0.05），表明转基因烟草中的膜脂过氧化反应程度较低，活性氧清除能力相对较高，从而提高了其耐旱性。因此，LpDREB9基因在增强转基因烟草耐旱机制方面具有关键作用，这为进一步从分子水平探究细叶百合的抗逆性奠定了基础。

关键词: 细叶百合, 转录因子, LpDREB9, 生物信息学分析, 表型, 耐旱性

Abstract:

The AP2/ERF transcription factors are plant-specific transcription factors. Among them， those in the DREB subfamily have been widely reported to improve plant resistance to abiotic stresses. To explore the roles of DREB family members in Lilium pumilum， we identified correlations between the transcript levels of DREB transcription factor genes and drought tolerance. We isolated the cDNA of the LpDREB9 gene from the roots of L. pumilum， and then conducted bioinformatics and subcellular localization analyses. This gene was then introduced into the model plant Nicotiana tabacum to elucidate its role in drought tolerance. The open reading frame （ORF） of LpDREB9 gene was 462 bp， encoding a protein of 153 amino acids with a relative molecular weight of 17.054 kDa， the fat index of 73.46， and a pI value of 4.89. It was an unstable and hydrophilic protein. Subsequent analysis revealed the nuclear localization of the LpDREB9 protein. In an alignment analysis， the LpDREB9 gene showed the closest evolutionary relationship with its homologs in Lilium regale. Seeds and seedlings of wild-type （WT） tobacco and transgenic tobacco expressing LpDREB9 were exposed to abscisic acid and drought stress. Phenotypic and physiological parameters of the seedlings after natural drought stress and subsequent rehydration were determined. The results indicated that the LpDREB9 gene enhanced drought tolerance in transgenic tobacco plants， particularly under prolonged drought stress. The activities of superoxide dismutase， peroxidase， and catalase， as well as chlorophyll and proline levels， were significantly higher in the LpDREB9 transgenic tobacco than in WT （P<0.05）. The malondialdehyde content was markedly lower in transgenic tobacco plants than in WT （P<0.05）， indicative of a lower level of membrane lipid peroxidation. These findings underscore the heightened capacity to scavenge reactive oxygen species in transgenic tobacco expressing LpDREB9， leading to enhanced drought tolerance. Hence， the LpDREB9 gene plays a pivotal role in augmenting the drought tolerance of transgenic tobacco. These findings provide the basis for further research on stress resistance at the molecular level in L. pumilum.

Key words: Lilium pumilum, transcription factor, LpDREB9, bioinformatics analysis, phenotypes, drought resistance

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图/表 10

图1 LpDREB9基因克隆M： DL2000 marker； 1~8： LpDREB9基因的PCR扩增产物PCR amplification product of LpDREB9 gene；灰色标注为氨基酸序列Gray marked as amino acid sequence. 下同The same below.

Fig.1 LpDREB9 gene cloning

表1 细叶百合LpDREB9转录因子理化性质分析

Table 1 Physicochemical properties analysis of LpDREB9 transcription factor in L. pumilum

基因名称

Gene

开放阅读框长度

Open reading frame length （bp）

氨基酸数量

Number of amino acids （aa）

相对分子量

Relative molecular weight （kDa）

不稳定系数

Instability

coefficient

脂肪指数

Fat index

蛋白质等电点

Protein isoelectric point

亲水指数

Hydropathy

index

亚细胞定位

Subcellular

localization

LpDREB9

图2 细叶百合LpDREB9蛋白序列分析（A）和蛋白进化分析（B）

Fig.2 Protein sequence analysis （A） and protein evolution analysis （B） of LpDREB9 in L. pumilum

图3 LpDREB9转基因烟草的获得及LpDREB9蛋白亚细胞定位CaMV 35S Pro：花椰菜花叶病毒的35S 启动子 35S promoter of cauliflower mosaic virus； GFP：绿色荧光蛋白 Green fluorescent protein； Nos：终止子Terminator；菌：质粒 DNA Plasmid DNA；水：无菌蒸馏水Sterile distilled water； CK：野生型烟草 Wild type （WT） tobacco； 1~7： LpDREB9转基因烟草抗性株系的扩增产物 Amplification products of LpDREB9 transgenic tobacco resistant lines； a： 1/2 MS培养基 1/2 MS medium； b：筛选培养基（1/2 MS 培养基+25 mg·L-1 Hyg） Screening medium （1/2 MS medium+25 mg·L-1 Hyg）. WT：野生型烟草WT tobacco； Tr 9-2， Tr 9-3， Tr 9-5：分别为LpDREB9转基因烟草抗性株系 LpDREB9 transgenic tobacco resistant line， respectively.下同The same below.

Fig.3 Acquisition of LpDREB9 transgenic tobacco and subcellular localization of LpDREB9 protein

图4 LpDREB9植株对ABA的敏感性分析不同小写字母表示相同浓度间差异显著（P<0.05，Duncan）。下同。Different lowercase letters indicate significant differences among the same concentration （P<0.05， Duncan）. The same below.

Fig.4 Sensitivity analysis of LpDREB9 plants to ABA

图5 甘露醇处理下转基因烟草种子的抗性分析

Fig.5 Resistance analysis of transgenic tobacco seeds under D-mannitol treatment

图6 甘露醇处理下转基因烟草幼苗的抗性分析

Fig.6 Resistance analysis of transgenic tobacco seedlings under D-mannitol treatment

图7 干旱胁迫下烟草成苗的抗性分析不同小写字母表示相同处理间差异显著（P<0.05，Duncan）。Different lowercase letters indicate significant differences among the same treatment （P<0.05， Duncan）.

Fig.7 Resistance analysis of tobacco seedling formation under drought stress

图8 烟草成苗干旱胁迫下不同天数的抗氧化酶活性变化不同小写字母表示相同处理天数间差异显著（P<0.05，Duncan）。下同。Different lowercase letters indicate significant differences among the same treatment day （P<0.05， Duncan）. The same below.

Fig.8 The changes of antioxidant enzyme activity in different days under drought stress of tobacco seedlings

图9 烟草成苗干旱胁迫不同天数下丙二醛、脯氨酸和叶绿素含量变化

Fig.9 Changes of malondialdehyde， proline and chlorophyll content in tobacco seedlings under drought stress in different days

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