2株青贮玉米根际固氮菌的筛选鉴定及促生作用研究

doi:10.11686/cyxb2023151

草业学报 ›› 2024, Vol. 33 ›› Issue (3): 174-185.DOI: 10.11686/cyxb2023151

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2株青贮玉米根际固氮菌的筛选鉴定及促生作用研究

孟超楠¹(), 赵玉洁¹(), 陈佳欣¹, 张旖璐¹, 王彦佳¹, 冯丽荣², 孙玉刚¹, 郭长虹¹()

^1.黑龙江省分子细胞遗传与遗传育种重点实验室，哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江哈尔滨 150000
^2.黑龙江国宏节能环保有限公司，黑龙江哈尔滨 150028

收稿日期:2023-05-08 修回日期:2023-06-28 出版日期:2024-03-20 发布日期:2023-12-27
通讯作者: 郭长虹
作者简介:. E-mail： kaku3008@126.com
孟超楠（1999-），女，河南驻马店人，在读硕士。E-mail： 3323466192@qq.com
赵玉洁（1996-），女，贵州贵阳人，硕士。E-mail： 347111947@qq.com。第一联系人：（孟超楠、赵玉洁并列第一作者）
基金资助:
国家自然科学基金(U21A20182);黑龙江省科技攻关项目(2021ZXJ03B05);哈尔滨师范大学研究生创新基金(HSDSS CX2021-05)

Screening and identification of two strains of nitrogen-fixing bacteria from the silage maize rhizosphere and their roles in plant growth promotion

Chao-nan MENG¹(), Yu-jie ZHAO¹(), Jia-xin CHEN¹, Yi-lu ZHANG¹, Yan-jia WANG¹, Li-rong FENG², Yu-gang SUN¹, Chang-hong GUO¹()

^1.Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Molecular Cellular Genetics and Genetic Breeding，College of Life Science and Technology，Harbin Normal University，Harbin 150000，China
^2.Heilongjiang Guohong Energy Conservation and Environmental Protection Co. ，Ltd. ，Harbin 150028，China

Received:2023-05-08 Revised:2023-06-28 Online:2024-03-20 Published:2023-12-27
Contact: Chang-hong GUO

摘要/Abstract

摘要：

为了获得优良的固氮菌，并评价其对青贮玉米的促生效果，本研究采用稀释涂布平板法，利用阿须贝氏固体培养基从青贮玉米根际土壤中分离筛选到10株固氮菌，对其固氮能力进行分析，结果表明，菌株ZL-2和ZL-13的固氮能力较强，菌株ZL-2的固氮量为1.07 μg·mL^-1，ZL-13的固氮量为0.95 μg·mL^-1。通过细菌形态学、16S rDNA序列分析和生理生化特征，确定菌株ZL-2为生癌肠杆菌和ZL-13为成团泛菌。对2株固氮菌的促生特性进行分析，结果表明，2个菌株具有泌铵能力、溶磷能力、产嗜铁素能力和合成吲哚-3-乙酸（IAA）的能力。盆栽试验结果表明，接种固氮菌ZL-2和ZL-13能够显著提高青贮玉米的株高、根长、地上和地下干、鲜重（P<0.05）。田间试验结果表明，2株固氮菌单接种和双接种均能提高青贮玉米的株高、茎粗、产量、粗蛋白含量和全磷含量（P<0.05）。接种2株固氮菌的青贮玉米，其氮代谢和氨同化相关基因（ZmAMT-4、ZmAMTB、ZmGOGAT2和ZmGS1-3）的表达量显著提高（P<0.05）。因此，2株固氮菌具有较好的促生特性，在提高青贮玉米的产量和品质方面发挥了重要作用，是开发微生物菌剂的优质菌种资源。

关键词: 青贮玉米, 固氮菌, 泌铵, 促生作用, 基因表达

Abstract:

The aim of this study was to screen for high-quality nitrogen-fixing bacteria and evaluate their growth-promoting effects on silage maize （Zea mays）. The dilution spread plate method with Ashby solid medium was used to screen and screen ten strains of nitrogen-fixing bacteria from the rhizosphere soil of silage maize. The nitrogen-fixation capabilities of the strains were analyzed. The results indicated that cultures of ZL-2 and ZL-13 exhibited strong nitrogen-fixing abilities （1.07 and 0.95 μg·mL^-1， respectively）. On the basis of their morphological characteristics， 16S rDNA sequence， and physiological and biochemical characteristics， ZL-2 was identified as Enterobacter cancerogenus， and ZL-13 was identified as Pantoea agglomerans. The growth-promoting characteristics of these two strains were analyzed， and both bacteria were found to secrete ammonium and siderophores， solubilize phosphate， and synthesize indole-3-acetic acid. In a pot experiment， compared with uninoculated silage maize plants， those inoculated with the nitrogen-fixing strains ZL-2 and ZL-13 showed significantly increased plant height， root length， aboveground and underground dry weights， and fresh weight （P<0.05）. In a field experiment， compared with uninoculated silage maize plants， those inoculated with one or both of the nitrogen-fixing strains showed significantly increased plant height， stem diameter， yield， crude protein content， and total phosphorus content （P<0.05）. Silage maize plants inoculated with these two nitrogen-fixing strains showed significantly increased expression levels of genes related to nitrogen metabolism and ammonia assimilation （ZmAMT-4， ZmAMTB， ZmGOGAT2， and ZmGS1-3）（P<0.05）. Therefore， these two nitrogen-fixing bacterial strains have favorable growth-promoting characteristics. Given their important role in enhancing the yield and quality of silage maize， they are valuable resources for the development of microbial agents.

Key words: silage maize, nitrogen-fixing bacteria, ammonium-secreting, growth-promoting function, gene expression

孟超楠, 赵玉洁, 陈佳欣, 张旖璐, 王彦佳, 冯丽荣, 孙玉刚, 郭长虹. 2株青贮玉米根际固氮菌的筛选鉴定及促生作用研究[J]. 草业学报, 2024, 33(3): 174-185.

Chao-nan MENG, Yu-jie ZHAO, Jia-xin CHEN, Yi-lu ZHANG, Yan-jia WANG, Li-rong FENG, Yu-gang SUN, Chang-hong GUO. Screening and identification of two strains of nitrogen-fixing bacteria from the silage maize rhizosphere and their roles in plant growth promotion[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2024, 33(3): 174-185.

图/表 10

表1 引物序列

Table 1 Primer sequence

基因名称 Gene name	正向引物序列 Forward primer sequence （5′→3′）	反向引物序列 Reverse primer sequence （5′→3′）
铵转运蛋白基因 ZmAMTB	CTACTGGGTAACTGCTGTCT	AACCCATCCACACGAGA
谷氨酰胺合成酶基因 ZmGS1-3	CTTCTGTATCCCTGAATCTACC	GTTACCGCATCATTGTCC
谷氨酸合成酶基因 ZmGOGAT2	TAGTGTTCCAACCTCTTTCC	AACACACCTTCCACGTTAG
铵转运蛋白基因 ZmAMT-4	TGACCTAATTGGTCGTGC	ATGGGGTCGCAAAGG
内参基因 GADPH	TGGGCCTACTGGTCTTACTACTGA	ACATACCCACGCTTCAGATCCT

图1 菌株的固氮能力不同小写字母表示不同处理之间差异显著（P<0.05）。下同。 Different lowercase letters indicate significant differences between different treatments （P<0.05）. The same below.

Fig.1 Nitrogen fixation capacity of strains

图2 菌株16S rDNA序列的系统发育树

Fig.2 Phylogenetic tree of strains 16S rDNA sequence

表2 菌株ZL-2和ZL-13生理生化特征

Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strains ZL-2 and ZL-13

指标 Index	菌株 Strains
指标 Index	ZL-2	ZL-13
甲基红 Methyl red	－	＋
伏普 Voges-proskaue	＋	＋
吲哚 Indole	＋	＋
葡萄糖 Glucose	＋	－
柠檬酸盐 Citrate	＋	＋
接触酶 Catalase	＋	＋
淀粉水解 Starch hydrolysis	＋	＋
硫化氢 H₂S	－	－
明胶液化 Gelatin liquefaction	－	－
脲酶 Urease	＋	－
革兰氏染色 Gram stain	－	－

图3 菌株ZL-2和ZL-13泌铵、溶磷、产嗜铁素及合成IAA能力同一色氨酸浓度下比较不同菌株合成IAA的差异性。Differences in IAA synthesis were compared among different strains at the same tryptophan concentration. *表示差异在P<0.05水平显著，**表示差异在P<0.01水平显著，***表示差异在P<0.001水平显著。* stands for significant difference at P<0.05 level， ** stands for significant difference at P<0.01， *** stands for significant difference at P<0.001.

Fig.3 Ammonium secretion， phosphorus solubilization， iron carrier and IAA production abilities of strains ZL-2 and ZL-13

表3 接种菌株ZL-2和ZL-13对青贮玉米幼苗生物量的影响

Table 3 Effect of strains ZL-2 and ZL-13 inoculated on the biomass of silage maize seedlings

处理组

Treatment

株高

Plant height

（cm）

根长

Root length

（cm）

地上鲜重

Fresh weight of shoot （g·plant^-1）

地下鲜重

Fresh weight of roots （g·plant^-1）

地上干重

Dry weight of shoot （g·plant^-1）

地下干重

Dry weight of roots （g·plant^-1）

图4 接种菌株ZL-2和ZL-13对青贮玉米生理特性的影响

Fig.4 Effect of strains ZL-2 and ZL-13 inoculated on the physiological characteristics of silage maize

表4 接种固氮菌对田间青贮玉米生物量的影响

Table 4 Effect of nitrogen-fixing strains inoculated on the biomass of silage maize in the field

处理组

Treatment

株高

Plant height （m）

茎粗

Stem diameter （mm）

鲜重

Fresh weight （kg·plant^-1）

干重

Dry weight （kg·plant^-1）

ZL-2

ZL-13

3.10±0.03ab

3.07±0.04b

39.36±0.25b

39.20±0.41b

2.13±0.05ab

2.05±0.04b

1.42±0.06ab

1.35±0.03b

图5 接种固氮菌对田间青贮玉米品质的影响

Fig.5 Effect of nitrogen-fixing strains inoculated on the quality of silage maize in the field

图6 接种菌株ZL-2和ZL-13对青贮玉米根、茎、叶中氮代谢和氨同化基因相对表达量的影响

Fig.6 Effects of strains ZL-2 and ZL-13 inoculated on the relative expression of nitrogen metabolism and ammonia assimilation genes in roots， stems and leaves of silage maize

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2株青贮玉米根际固氮菌的筛选鉴定及促生作用研究

Screening and identification of two strains of nitrogen-fixing bacteria from the silage maize rhizosphere and their roles in plant growth promotion

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