长叶红砂钙依赖蛋白激酶RtCDPK16的非生物胁迫应答分析

doi:10.11686/cyxb2022198

摘要/Abstract

摘要：

植物受到逆境刺激后，钙离子结合蛋白能够感知钙信号并将其解码，激活下游靶蛋白，从而引发胁迫应答反应，钙调蛋白激酶在其中发挥了重要作用。长叶红砂为东阿拉善-西鄂尔多斯特有的珍稀泌盐植物，对干旱、盐碱等环境胁迫具有极强的适应性。本研究基于转录组数据，克隆了长叶红砂钙调蛋白激酶RtCDPK16的开放阅读框（open reading frame， ORF），氨基酸序列比对和进化分析显示，其与拟南芥的同源性为78.46%，与葡萄VvCDPK16同源性最高（80.97%）。基因表达特性分析显示，RtCDPK16在根茎叶中均表达，且在根中表达量最高，同时其表达水平可被氯化钠（NaCl）/聚乙二醇（polyethylene glycol， PEG）/冷胁迫（cold stress， cold）/脱落酸（abscisic acid， ABA）等多种环境胁迫和氯化钙（calcium chloride， CaCl₂）显著诱导。构建植物表达载体并转化拟南芥，对野生型拟南芥（WT）和过表达拟南芥（OE）株系进行干旱、盐和脱落酸胁迫，发现胁迫处理下OE株系的根长、鲜重和叶绿素含量等表型指标均显著高于WT，表明RtCDPK16的超表达使转基因株系获得了更强的胁迫耐受性；生理生化指标检测显示，胁迫处理下各株系中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、过氧化物酶（peroxidase， POD）和过氧化氢酶（catalase， CAT）等抗氧化酶活性及脯氨酸（proline， Pro）、可溶性糖（soluble sugar， SS）等渗透调节物质的含量均被显著诱导，且超表达株系显著高于WT，而过氧化氢（hydrogen peroxide， H₂O₂）/超氧阴离子（superoxide anion， O₂^-）的积累量显著低于WT；实时荧光定量（quantitativereal-time， qRT-PCR）检测发现，胁迫条件下OE株系的相关抗氧化酶基因、ABA合成和信号途径关键元件基因及脯氨酸合成基因均被显著诱导。以上结果表明，RtCDPK16在拟南芥中的超表达通过调控转基因植物中抗氧化和渗透调节系统相关基因的表达和酶活性，促进转基因植物的渗透平衡和活性氧（reactive oxygen species， ROS）稳态的维持，进而提高转基因植物的胁迫耐受性，这一过程可能是通过依赖于ABA信号的途径实现的。

关键词: 长叶红砂, 非生物胁迫, RtCDPK16, 抗氧化, 渗透调节

Abstract:

Calmodulin kinase is a crucial component of calcium-binding proteins， which read and decode calcium signals and activate downstream target proteins to initiate stress responses in plants after stress stimulation. Reaumuria trigyna， a rare and uncommon salt-producing plant found only in east Alxa and west Ordos， is very resilient to environmental challenges including drought and salinity. Based on transcriptome information， the open reading frame （ORF） of RtCDPK16 was cloned in this study. The ORF shared 78.46% similarity with Arabidopsis thaliana and 80.97% identity with CDPK16 in Vitis vinifera， according to amino acid sequence alignment and evolutionary analyses. RtCDPK16 was found to be expressed in roots， stems， and leaves， with roots expressing it at the highest level. Stress conditions such as sodium chloride （NaCl）/macrogol （polyethylene glycol， PEG）/cold stress （cold）/abscisic acid （ABA） and other environmental stresses and calcium chloride （CaCl₂） were shown to greatly increase RtCDPK16 expression levels. Construction of plant expression vector and transformation of A. thaliana. Drought， salt and abscisic acid stress were applied to wild type Arabidopsis （WT） and overexpression Arabidopsis （OE） strains. The results showed that root length， fresh weight， chlorophyll content and other phenotypic indicators of OE strain were significantly higher than WT under stress treatment， indicating that the overexpression of RtCDPK16 made the transgenic strain obtain stronger stress tolerance. Physiological and biochemical indexes showed that， in each strain under stress treatment， the activities of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase （SOD）， Peroxidase （POD）， catalase （CAT） and the content of osmotic regulators such as proline （Pro） and soluble sugar （SS） were significantly induced， and the OE strain was significantly higher than WT， while the accumulation of hydrogen peroxide （H₂O₂）/superoxide anion （O₂^-） was significantly lower than WT. Quantitative real-time （RT-PCR） detection found that the genes related to antioxidant enzymes， ABA synthesis and key elements of signal pathway， and proline synthesis genes of OE strains were significantly induced under stress. The above results indicate that the overexpression of RtCDPK16 in Arabidopsis can promote the osmotic balance and ROS （reactive oxygen species） homeostasis by regulating the genes expression of antioxidant enzyme and osmotic regulation in transgenic plants， and thus improve the stress tolerance of transgenic plants. This process may be achieved through ABA signal dependent approaches.

Key words: Reaumuria trigyna, abiotic stress, RtCDPK16, antioxidant, osmotic regulation

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图/表 10

表1 RT-PCR引物序列

Table 1 RT-PCR primer sequences （5′-3′）

引物Primer	上游引物序列Forward primer sequences （F）	下游引物序列Reverse primer sequences （R）
RtCDPK16	CGCTCTAGAATGGGTTCTTGTTTCTC	CGCGAGCTCTCACAGCTTACGTGAA
RtCDPK16-Q	GTGGATGCTCAAGCGAGAAGTC	TCCAGCAATTCACCGCCTTCAC
RtActin-Q	CTGGATTCTCCTGATGGTGTGTCT	GAACCACCGATCCAGACTCGATAC
RtCDPK16-1300	CGCGAGCTCATGGGTTCTTGTTT	CGCTCTAGACAGCTTACGTGAAG
AtActin	CTGGATTCTGGTGATGGTGTGTCT	GAACCACCGATCCAGACACTGTAC
AtPOD1	AAAGCGAACATTTTACTCTGGG	CAACAAGTCAATCCTCTAGG
AtSOD1	AGGAAACATCACTGTTGGAGAT	GAGTTTGTGATCGCAGAGAGGAA
AtCAT1	TCCTGTTATCGTTCGTTTCTCA	CAAAGTTCCCCTCTCTGGTGTA
AtAPX1	AAATACGTCCCTGATGAAGATG	CGAGCTACGATCGCACACAG
AtP5CS1	GCGCATAGTTTCTGATGCAA	TGCAACTTCGTGATCCTCTG
AtRD29A	TTCTGTAAGGACGACGTTTACA	CGTACTCGTTACATCCTCTGTT
AtDREB2A	AACCTGTCAGAACAACAGCAGG	TTAAGCCTGCAAACACATCGTCGC
AtRD22	GATTTGTCTATGCACTGCTCTG	TGGAAGCTTTCTGTTACAAACG
AtABF4	AACAACTTAGGAGGTGGTGGTC	CTTCAGGAGTTCATCCATGTTC
AtSnRK2.2	ATATGCCATCGGGATCTGAA	TTGGTTGGGAATGAAGAACAG
AtSnRK2.3	GTTGGATGGAAGTCCTGCTC	TGCCATCATATTCCTGACGA
AtNCED3	GATGAATTTGTTACTGAGAGCG	AACACTAGGATCAGCCGTTTTA

图1 RtCDPK16基因氨基酸序列比对和进化分析*：代表长叶红砂中的RtCDPK16这个基因 Represents the gene RtCDPK16 in R. trigyna

Fig.1 Amino acid sequence alignment and evolution analysis of RtCDPK16

图2 RtCDPK16的表达特性与亚细胞定位分析不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。下同。Different lowercase letters indicate significant differences between the different treatments at the 0.05 level. The same below.

Fig.2 RtCDPK16 specific expression and subcellular localization analysis

图3 RtCDPK16转基因拟南芥的鉴定M：标记；WT：野生型；D1~D6： RtCDPK16的6个过表达株系。下同。M： Marker；WT： Wild-type； D1-D6： Six overexpressing lines of RtCDPK16. The same below.

Fig.3 Identification of RtCDPK16 transgenic A. thaliana

图4 不同胁迫对转基因拟南芥幼苗存活率和根部发育的影响

Fig.4 Effects of different stress on the survival rate and root development of transgenic Arabidopsis seedlings

图5 不同胁迫下拟南芥的生长表型及生理指标

Fig.5 Growth phenotype， and physiological indicators of Arabidopsis under different stress

图6 不同胁迫下的拟南芥叶片的DAB与NBT染色

Fig.6 DAB and NBT staining of Arabidopsis leaves under different stress

图7 不同胁迫下的拟南芥ROS的积累

Fig.7 ROS accumulation of Arabidopsis under different stress

图8 不同胁迫下拟南芥的抗氧化酶活性和渗透调节物质含量

Fig.8 Antioxidant enzyme activity and content of osmotic regulators of Arabidopsis under different stress

图9 不同胁迫下相关基因的表达量

Fig.9 Expression of related genes under different stress

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