紫花苜蓿MsNAC053基因克隆及其对非生物胁迫的响应分析

doi:10.11686/cyxb2024404

摘要/Abstract

摘要：

NAC（NAM、ATAF1/2、CUC1/2）转录因子是植物特有的转录因子，在调控植物生长发育、激素信号转导及胁迫响应等过程中发挥重要作用。紫花苜蓿是世界范围内重要的豆科牧草之一，营养丰富，品质优良。为探究紫花苜蓿NAC053基因功能，利用SnapGene及NCBI设计特异性引物并利用PCR技术克隆MsNAC053基因，利用生物信息学软件分析其蛋白质理化性质、二级结构和亚细胞定位情况等，并使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析MsNAC053基因在紫花苜蓿不同组织中的表达模式及对不同非生物胁迫的响应情况，利用农杆菌介导法将DNA酶切及连接构建的亚细胞定位载体导入烟草叶片进行亚细胞定位。结果表明：MsNAC053基因编码区全长903 bp，编码300个氨基酸，其蛋白相对分子量为34.62 kDa，脂溶指数为73.82，理论等电点为7.05，平均亲水性为-0.604，不稳定系数为47.28，为不稳定的亲水性蛋白，不具备跨膜结构，具有响应冷胁迫及脱落酸等的顺式作用元件。亚细胞定位结果显示其定位于细胞核中，系统进化树和氨基酸序列分析表明MsNAC053与蒺藜苜蓿、长柔毛野豌豆等豆科植物亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明，MsNAC053基因表达具有组织特异性，在幼叶中表达量最高，在子叶中表达量最低；干旱、盐及脱落酸（ABA）处理均能诱导MsNAC053基因的表达，表明MsNAC053基因参与紫花苜蓿应对干旱、盐胁迫响应。本研究为紫花苜蓿抗逆分子育种提供了理论依据及候选基因。

关键词: 紫花苜蓿, NAC转录因子, 基因克隆, 表达分析, 非生物胁迫

Abstract:

The NAC （NAM， ATAF1/2， CUC1/2） transcription factors are plant-specific regulators that play critical roles in plant growth and development， hormone signaling， and stress responses. Alfalfa （Medicago sativa）， one of the most important leguminous forage crops worldwide， is renowned for its high nutritional value and quality. To investigate the function of the MsNAC053 gene in alfalfa， specific primers were designed using SnapGene and NCBI to clone MsNAC053 through polymerase chain reaction （PCR） technology. The physicochemical properties， secondary structure， and subcellular localization of the protein were analyzed through bioinformatics tools. And the tissue-specific expression patterns of MsNAC053 and its responses to abiotic stresses were analyzed through quantitative real-time PCR （qRT-PCR）. The subcellular localization analysis were conducted by introducing vector into tobacco （Nicotianatabacum） leaves via Agrobacterium-mediated transformation. The results showed that the coding region of MsNAC053 was 903 bp， encoding 300 amino acids， with a predicted molecular weight of 34.62 kDa， an aliphatic index of 73.82， a theoretical isoelectric point （pI） of 7.05， a grand average hydropathicity of -0.604， and an instability coefficient of 47.28， categorizing it as an unstable hydrophilic protein without transmembrane regions. Cis-acting elements responsive to low-temperature （LTR） and abscisic acid responsiveness （ABRE） were identified. Subcellular localization confirmed that MsNAC053 was localized in nucleus. Phylogenetic and amino acid sequence analyses revealed close evolutionary relationships between MsNAC053 and other NAC proteins from leguminous species such as Medicago truncatula and Vicia villosa. qRT-PCR demonstrated tissue-specific expression of MsNAC053， with the highest expression level in young leaves and the lowest expression level in cotyledons. Drought， salt， and ABA treatments significantly upregulated the expression level of MsNAC053， indicating that it plays a role in response to drought and salt stresses. In summary， the results of this study provides both theoretical insights and a candidate gene for molecular breeding of stress-resistant alfalfa varieties.

Key words: alfalfa, NAC transcription factor, gene cloning, expression analysis, abiotic stress

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图/表 12

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引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence （5′-3′）
NAC053-F	ATGGCATCAATGGAGGACATCAAC
NAC053-R	TTAAAAATTCAGGATATTAGTGTAAGCACTCC
qNAC053-F	ACGCATAATCGGGTTGAGGAAG
qNAC053-R	TAGGCAAGGGGCTATTGTCAGG
ACTIN-F	CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGAT
ACTIN-R	CATGACACCAGTATGACGAGGTCG

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence （5′-3′）
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NAC053-R	TTAAAAATTCAGGATATTAGTGTAAGCACTCC
qNAC053-F	ACGCATAATCGGGTTGAGGAAG
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ACTIN-F	CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGAT
ACTIN-R	CATGACACCAGTATGACGAGGTCG

软件名称 The name of software	分析项目 The item analyzed	网址 Website
NCBI-Blast	序列比对Sequence alignment	https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/
Evolview	系统进化树美化Phylogenetic tree beautification	https：//www.evolgenius.info/evolview/
SMART	保守结构域分析Conservative domain analysis	https：//smart.embl.de/
NCBI-conserved domain	保守结构域分析Conservative domain analysis	https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/
PlantCARE	顺式作用元件分析Cis-acting element analysis	https：//bioinformatics.psb.ugent.be/
ExPasy	蛋白理化性质分析The characteristic analysis of physical and chemical of protein	https：//www.expasy.org/
TMHMM	蛋白跨膜结构分析Protein transmembrane structure analysis	https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
SOPMA	蛋白二级结构分析Secondary structure analysis of protein	https：//npsa-prabi.ibcp.fr/
Swiss-Model	蛋白三级结构分析Tertiary structure analysis of protein	https：//swissmodel.expasy.org/
Cell-Ploc 2.0	亚细胞定位分析Subcellular localization analysis	http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/
SignalP 5.0	蛋白信号肽分析Signal peptide analysis of protein	https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/
NetPhos 3.1	蛋白磷酸化位点分析Phosphorylation site analysis of protein	https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/
NetGlycate 1.0	蛋白糖基化位点分析Glycosylation site analysis of protein	https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetGlycate-1.0/
DNAMAN 7.0	序列比对Sequence alignment	本地软件Local software
MEGA 6.0	系统进化树构建Phylogenetic tree construction	本地软件Local software
SnapGene	序列比对Sequence alignment	本地软件Local software
TBtools	系统进化树美化Phylogenetic tree beautification	本地软件Local software

软件名称 The name of software	分析项目 The item analyzed	网址 Website
NCBI-Blast	序列比对Sequence alignment	https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/
Evolview	系统进化树美化Phylogenetic tree beautification	https：//www.evolgenius.info/evolview/
SMART	保守结构域分析Conservative domain analysis	https：//smart.embl.de/
NCBI-conserved domain	保守结构域分析Conservative domain analysis	https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/
PlantCARE	顺式作用元件分析Cis-acting element analysis	https：//bioinformatics.psb.ugent.be/
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NetPhos 3.1	蛋白磷酸化位点分析Phosphorylation site analysis of protein	https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/
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DNAMAN 7.0	序列比对Sequence alignment	本地软件Local software
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SnapGene	序列比对Sequence alignment	本地软件Local software
TBtools	系统进化树美化Phylogenetic tree beautification	本地软件Local software

氨基酸 Amino acid	数目 Number	含量 Content （%）	氨基酸 Amino acid	数目 Number	含量 Content （%）
丙氨酸Alanine （Ala， A）	11	3.7	赖氨酸Lysine （Lys， K）	25	8.3
精氨酸Arginine （Arg， R）	14	4.7	甲硫氨酸Methionine （Met， M）	10	3.3
天冬酰胺Asparagine （Asn， N）	13	4.3	苯丙氨酸Phenylalanine （Phe， F）	12	4.0
天冬氨酸Asparticacid （Asp， D）	18	6.0	脯氨酸Proline （Pro， P）	20	6.6
半胱氨酸Cysteine （Cys， C）	4	1.3	丝氨酸Serine （Ser， S）	22	7.3
谷氨酰胺Glutamine （Gln， Q）	14	4.7	苏氨酸Threonine （Thr， T）	20	6.6
谷氨酸Glutamicacid （Glu， E）	21	7.0	色氨酸Tryptophan （Trp， W）	7	2.3
甘氨酸Glycine （Gly， G）	16	5.3	酪氨酸Tyrosine （Tyr， Y）	9	3.0
组氨酸Histidine （His， H）	7	2.3	缬氨酸Valine （Val， V）	15	5.0
异亮氨酸Isoleucine （Ile， I）	16	5.3	吡咯酪氨酸Pyrrolysine （Pyl， O）	0	0.0
亮氨酸Leucine （Leu， L）	27	9.0	硒代胱氨酸Selenocysteine （Sec， U）	0	0.0