紫花苜蓿与红豆草在不同生长时期缩合单宁合成差异的比较研究

doi:10.11686/cyxb2025115

摘要/Abstract

摘要：

本研究以‘甘农3号’、‘甘农7号’、‘精英’紫花苜蓿及‘甘肃’红豆草为材料，分析苗期至成熟期6个生长期茎、叶部位总酚、总黄酮、缩合单宁（CT）及次生代谢产物（芦丁、没食子酸、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、儿茶素）动态积累规律，并测定苯丙烷代谢途径关键酶［苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）］和类黄酮途径［花青素还原酶（ANR）、无色花色素还原酶（LAR）］活性，以解析缩合单宁合成调控机制。结果表明：1）缩合单宁含量随生育期推进呈显著变化，‘甘肃’红豆草现蕾期、紫花苜蓿结荚期为累积高峰期，且叶部含量普遍高于茎部；2）总黄酮与芦丁含量变化趋势与缩合单宁相似；3）4CL、ANR、PAL、LAR和C4H活性在‘甘肃’红豆草现蕾期、紫花苜蓿结荚期显著升高，表明苯丙烷代谢向缩合单宁合成方向增强。品种间比较显示，‘甘农3号’紫花苜蓿缩合单宁含量在结荚期显著高于其他品种（P<0.05），表示其具有更强单宁合成潜力。本研究明确了 CT 合成关键酶与代谢产物的动态关联，为牧草 CT 代谢调控及高单宁品种选育提供理论依据。

关键词: 紫花苜蓿, 红豆草, 缩合单宁, 酚酸

Abstract:

In this study， we explored the differences in condensed tannin （CT） synthesis and accumulation between alfalfa （Medicago sativa） and sainfoin （Onobrychis viciifolia）. Stems and leaves of the alfalfa cultivars ‘Gannong No. 3’， ‘Gannong No. 7’， and ‘Elite’， and the sainfoin ‘Gansu’ were sampled across six growth stages from seedling to maturity. The contents of total phenolics， total flavonoids， CTs， and secondary metabolites （rutin， gallic acid， epicatechin gallate， epicatechin， catechin） were determined. In addition， to decipher the regulatory mechanism of condensed tannin synthesis， we measured the activities of key enzymes in the phenylpropanoid metabolic pathway （phenylalanine ammonia-lyase， PAL； 4-coumarate-CoA ligase， 4CL； cinnamate 4-hydroxylase， C4H） and the flavonoid pathway （anthocyanidin reductase， ANR and leucoanthocyanidin reductase， LAR）. The results show that： 1） The condensed tannin content varied significantly among growth stages， peaking at the bud stage in O. viciifolia ‘Gansu’ and the pod-setting stage in M. sativa， while the condensed tannin content was generally higher in leaves than in stems. 2） The trends in the contents of total flavonoids and rutin were analogous to those of condensed tannins. 3） The activities of 4CL， ANR， PAL， LAR， and C4H significantly increased at the bud stage of O. viciifolia ‘Gansu’ and the pod-setting stage of M. sativa， indicative of enhanced metabolic flow of the phenylpropanoid pathway towards condensed tannin synthesis. Among the alfalfa varieties， M. sativa ‘Gannong No. 3’ exhibited significantly higher condensed tannin content at the pod-setting stage （P<0.05）， suggesting stronger tannin synthesis potential. The results of this study clarify the dynamic correlations between key CT synthesis enzymes and metabolites， providing a theoretical basis for metabolic regulation of CT in forage crops and for breeding high-tannin varieties.

Key words: Medicago sativa, Onobrychis viciifolia, condensed tannins, phenolic acids

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图/表 15

表1 流动相梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution program of the mobile phase

时间 Time （min）	流速 Flow rate （mL·min^-1）	流动相 Mobile phase （A，%）	流动相 Mobile phase （B，%）
0.0	1.0	5	95
15.0	1.0	20	80
23.0	1.0	25	75
25.0	1.0	30	70
26.0	1.0	40	60
26.5	1.0	5	95
31.0	1.0	5	95

表2 黄酮类化合物超高效液相色谱检测标准曲线

Table 2 Calibration curve analysis of flavonoid compounds by ultra performance liquid chromatography （UPLC）

化合物 Compound	保留时间 Retention time （min）	回归方程 Calibration curve equation	决定系数 Determination coefficient （R2）
芦丁 Rutin	20.911	y=6072.9x+3.537	1.0000
没食子酸 Gallic acid	7.043	y=30842.0x-157055.000	0.9999
表儿茶素没食子酸酯 Epicatechin gallate	21.957	y=16244.0x-60958.000	0.9994
表儿茶素 Epicatechin	16.745	y=7278.5x-4627.600	1.0000
儿茶素 Eatechin	13.979	y=7794.4x-25134.000	0.9993

图1 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草芦丁含量SE：苗期 Seedling； BR：分枝期 Branching； BU：现蕾期 Budding； FL：开花期 Flowering； PO：结荚期 Podding； MT：成熟期 Maturity. GN3： ‘甘农3号’ Gannong No.3； GN7： ‘甘农7号’ Gannong No.7； ALF-E：紫花苜蓿‘精英’ Alfalfa ‘Elite’； GSHD： ‘甘肃’红豆草 O. viciifolia ‘Gansu’. S：茎 Stem； L：叶 Leaf. GN7-S： ‘甘农7号’茎部位 Gannong No.7 stem； GN7-L： ‘甘农7号’叶部位 Gannong No.7 leaf； GN3-S： ‘甘农3号’茎部位 Gannong No.3 stem； GN3-L： ‘甘农3号’叶部位 Gannong No.3 leaf； ALF-E-S：紫花苜蓿‘精英’茎部位 Alfalfa ‘Elite’ stem； ALF-E-L：紫花苜蓿‘精英’叶部位 Alfalfa ‘Elite’ leaf； GSHD -S： ‘甘肃’红豆草茎部位 O. viciifolia ‘Gansu’ stem； GSHD-L： ‘甘肃’红豆草叶部位 O. viciifolia ‘Gansu’ leaf. 所有数据进行多重比较，不同小写字母表示不同品种不同部位同一时期差异显著（P<0.05）；下同。Statistical analysis： All data were subjected to multiple comparison tests. Different lowercase letters indicate significant differences （P<0.05） among cultivars and plant parts within the same growth stage. The same below.

Fig.1 Rutin content in M. sativa and O. viciifolia ‘Gansu’ at different growth stages

图2 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草没食子酸含量

Fig.2 Gallic acid content in M. sativa and O. viciifolia ‘Gansu’ at different growth stages

图3 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草表儿茶素没食子酸酯含量

Fig.3 Temporal variation in epicatechin gallate content of alfalfa cultivars and O. viciifolia ‘Gansu’ during distinct growth stages

图4 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草表儿茶素含量

Fig.4 Epicatechin content in M. sativa and O. viciifolia ‘Gansu’ at different growth stages

图5 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草儿茶素含量

Fig.5 Catechin content in M. sativa and O. viciifolia ‘Gansu’ at different growth stages

图6 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草总酚含量

Fig.6 Total phenolic content in M. sativa and O. viciifolia ‘Gansu’ at different growth stages

图7 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草总黄酮含量

Fig.7 Total flavonoid content in M. sativa and O. viciifolia ‘Gansu’ at different growth stages

图8 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草缩合单宁含量

Fig.8 Condensed tannins content in M. sativa and O. viciifolia ‘Gansu’ at different growth stages

图9 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草4CL、ANR、C4H 、LAR和 PAL 酶活性动态GN3-L-PO： ‘甘农3号’叶部位结荚期 leaf part of ‘Gannong No.3’ at pod-setting stage； GN3-L-FL： ‘甘农3号’叶部位开花期 leaf part of ‘Gannong No.3’ at flowering stage； GSHD-L-BU： ‘甘肃’红豆草叶部位现蕾期 leaf part of O. viciifolia ‘Gansu’ at budding stage； GSHD-L-BR： ‘甘肃’红豆草叶部位分枝期 leaf part of O. viciifolia ‘Gansu’ at branching stage. 所有数据进行多重比较，不同小写字母表示不同品种不同部位同一时期差异显著（P<0.05）；下同。Statistical analysis： All data were subjected to multiple comparison tests. Different lowercase letters indicate significant differences （P<0.05） among cultivars and plant parts within the same growth stage； The same below.

Fig.9 Dynamic analysis of 4CL， ANR， C4H， LAR and PAL enzyme activities in M. sativa and O. viciifolia ‘Gansu’ at different growth stages

图10 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草茎部酚类和黄酮类化合物含量分析

Fig.10 Analysis of phenolic and flavonoid compound contents in the stems of M. sativa and O. viciifolia ‘Gansu’ at different growth stages

图11 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草叶部酚类和黄酮类化合物含量分析

Fig.11 Analysis of phenolic and flavonoid compound contents in the leaves of M. sativa and O. viciifolia ‘Gansu’ at different growth stages

图12 紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草酚类和黄酮类化合物及酶活性分析

Fig.12 Analysis of phenolic， flavonoid compounds and enzyme activities in M. sativa and O. viciifolia ‘Gansu’

图13 ‘甘农3号’紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草酚类和黄酮类化合物及酶活性相关性分析A：芦丁 Rutin；B：没食子酸 Gallic acid；C：表儿茶素没食子酸酯 Epicatechin gallate；D：表儿茶素 Epicatechin；E：儿茶素 Catechin；F：总酚 Total phenols；G：总黄酮 Total flavonoids；H：缩合单宁 Condensed tannins；I：4CL；J：ANR；K：C4H；L：PAL；M：LAR；红色/蓝色示正/负相关，颜色越深相关性越强；黑色斜点/白色斜杠示相关性不显著（P≥0.05），无标识表示显著（P<0.05）。Red/blue colors indicate positive/negative correlations， with darker shades representing stronger correlations. Black diagonal dots or white slashes denote non-significant correlations （P≥0.05）， while the absence of symbols indicates significant correlations （P<0.05）.

Fig.13 Analysis of the correlation among phenolic and flavonoid compounds and enzyme activities in M. sativa ‘Gannong No.3’ and O. viciifolia ‘Gansu’

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